分析膠體金檢測卡方案檢測原理

    膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，金離子還原后聚合成的一定大小的金顆粒，它由一個基礎的晶核（11個金原子形成的二十面體）和包圍在外的雙離子層構成（內層為負離子層AuCl2－，外層是帶正電荷的H＋）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的疏水膠溶液，故稱膠體金。 。質量差的溶液燒制后，液面有漂浮物，大小不一，形狀各異。膠體金顆粒大小，決定了我們用肉眼觀察到的膠體金溶液顏色，由紅到紫色。

    膠體金一般在弱堿環境下帶負電荷，會與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，一般稱這種結合叫靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。除了與蛋白質結合以外，它還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，從而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。 

    膠體金標記技術，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。用于膠體金標記的蛋白必須要經過前處理，其目的在于1、去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結合，或導致膠體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液來進行。2、使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結合，影響標記的靈敏度和定量分析。3、使蛋白具有適當的分子量。蛋白分子量過?。?0 kD），形成的蛋白復合體往往是不穩定，可短時間內失活。而分子量過大時，被認為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結構與活性中心的情況下，去除對活性影響的結構部分是提高標記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如牛血清蛋白等）結合后，能制備出穩定性更強的探針。 

    當蛋白前處理完成后，接著要確定膠體金與蛋白結合的*pH值。對于理化性質不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值的膠體金結合后，只有某一特定pH值能夠形成結合zui穩定的探針。在高濃度電解質（如NaCl）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇zui小適宜pH值為*pH值。但有些探針的實際情況并不*如此，zui穩定的探針并不*代表活性，這要靠實驗驗證。在確定*pH值后，zui后要確定zui小蛋白量，即能夠形成穩定探針的蛋白的zui小量。如果在制備探針時加入太多的蛋白，不僅造成浪費，而且更為嚴重的是容易造成探針凝聚，并嚴重影響標記活性。因為探針溶液中的游離蛋白容易搶先與標記位點結合，起到“封閉”（Blocking）作用，而膠體金探針標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。 

    膠體金具有很高的動力學穩定性，在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數年不發生凝聚。影響穩定的因素主要有電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。金溶膠必須有少量電解質作穩定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質能剝去膠粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質反而可增加溶膠穩定性，如蛋白質、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩定效果。

    當金溶膠吸附蛋白質后，溶膠的穩定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩定，提高pH則顯得不穩定，接近等電點或略高時又變得穩定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩定劑。在4～10℃貯存數月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發生程度不同的凝聚，可離心除去。